ஒரு குப்பி, இரண்டு இலக்குகள்: 100% உணர்திறனுடன் எடுத்துச் செல்லக்கூடிய CRISPR-அடிப்படையிலான காசநோய் கண்டறிதல்

சிக்கலான உபகரணங்கள் இல்லாமல், சளியிலிருந்து நேரடியாகச் செய்யக்கூடிய ஒரு சிறிய காசநோய் பரிசோதனை பற்றிய ஒரு ஆய்வறிக்கை, சயின்ஸ் அட்வான்சஸில் வெளியிடப்பட்டது. ஐசோதெர்மல் டிஎன்ஏ பெருக்கம் மற்றும் CRISPR வாசிப்பு ஆகியவை ஒரே சோதனைக் குழாயில் இணைக்கப்படுகின்றன; இரண்டு பழமைவாத எம். காசநோய் செருகல்கள் (IS6110 மற்றும் IS1081) ஒரே நேரத்தில் சோதிக்கப்படுகின்றன, மேலும் ஒரு மனித மரபணுவை உள் மாதிரி கட்டுப்பாட்டாக சோதிக்கின்றன. மருத்துவ மாதிரிகளில் ஒரு சிறிய "குருட்டு" சோதனையில், சோதனை 100% உணர்திறன் (6/6) மற்றும் கலாச்சாரத்துடன் ஒப்பிடும்போது 100% குறிப்பிட்ட தன்மை (7/7) ஆகியவற்றைக் கொடுத்தது; உருவகப்படுத்தப்பட்ட சளியில் கண்டறிதல் வரம்பு ~69–81 CFU/ml ஆகும். முடிவை ஒரு காகித சோதனைப் பட்டையில் காணலாம், மேலும் வினைப்பொருட்கள் லியோபிலைஸ் செய்யப்படுகின்றன ("குளிர் சங்கிலி" இல்லாமல் சேமிப்பு).

பின்னணி

WHO-வின் கூற்றுப்படி, 2023-ல் காசநோய் சுமார் 1.25 மில்லியன் மக்களைக் கொல்லும்; காசநோய் மீண்டும் மரணத்திற்கான முன்னணி தொற்று காரணியாக மாறியுள்ளது, 10.8 மில்லியன் நோயாளிகள் இருப்பதாக மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது. இது அணுகக்கூடிய மற்றும் விரைவான நோயறிதலை மிகவும் முக்கியமானதாக ஆக்குகிறது, குறிப்பாக வளங்கள் குறைவாக உள்ள சூழல்களில்.

• தற்போதைய சோதனைகள் துல்லியம், வேகம் மற்றும் விலைக்கு இடையிலான சமரசமாகும். "தங்கத் தரநிலை" கலாச்சாரம் மிகவும் துல்லியமானது ஆனால் மெதுவாக உள்ளது; நுண்ணோக்கி வேகமானது ஆனால் உணர்வற்றது; Xpert MTB/RIF Ultra போன்ற PCR தளங்கள் கணிசமாக அதிக உணர்திறன் கொண்டவை (LOD ≈ 15.6 CFU/ml), ஆனால் விலையுயர்ந்த உபகரணங்கள் மற்றும் தோட்டாக்கள் தேவைப்படுகின்றன, இது கவரேஜைக் கட்டுப்படுத்துகிறது.
• ஏன் ஐசோதெர்மல் மற்றும் CRISPR. ஐசோதெர்மல் RPA பெருக்கம் 37–42 °C இல் வேலை செய்கிறது மற்றும் வெப்ப சுழற்சிகள் தேவையில்லை - "புலத்தில்" வசதியானது. CRISPR வாசிப்பு (Cas12/13) இனங்கள் தனித்தன்மையைச் சேர்க்கிறது மற்றும் சிக்கலான ஒளியியல் இல்லாமல் காட்சி பக்கவாட்டு ஓட்டத்தை ("ஸ்ட்ரிப்") அனுமதிக்கிறது. மொத்தத்தில், இது சிறிய மற்றும் மலிவான PVR சோதனைகளுக்கான பாதையாகும்.
• ஒரே நேரத்தில் இரண்டு MBT இலக்குகள் ஏன் (IS6110 + IS1081). IS6110 என்பதுM. காசநோய் வளாகத்தின் பல நகல் செருகலாகும், ஆனால் சில வரிகளில் சில பிரதிகள் உள்ளன, மேலும் IS6110 க்கான சோதனைகள் மட்டும் "தவறவிடக்கூடும்". இரண்டாவது IS1081 செருகலைச் சேர்ப்பது தவறான-எதிர்மறை முடிவுகளின் அபாயத்தைக் குறைக்கிறது.
• ஏன் உள் மனித கட்டுப்பாடு. சுவாச மாதிரிகளில் தடுப்பான்கள் மற்றும் "மோசமான" மாதிரிகள் இருக்கலாம். எண்டோஜெனஸ் மனித கட்டுப்பாடு (எ.கா. RNase P/ஜெனோமிக் டி.என்.ஏ) பொருள் போதுமானது மற்றும் எதிர்வினை அடக்கப்படவில்லை என்பதை உறுதிப்படுத்துகிறது - இல்லையெனில் முடிவை எதிர்மறையாகக் கருத முடியாது.
• ஒரு-பானை வடிவம் தானே முக்கியமானது. இது படிகளைக் குறைக்கிறது, மாசுபடுவதற்கான அபாயத்தைக் குறைக்கிறது மற்றும் ஆய்வகத்திற்கு வெளியே வேலையை எளிதாக்குகிறது. காசநோய்க்கான இத்தகைய அணுகுமுறைகள் ஏற்கனவே நம்பகத்தன்மையைக் காட்டியுள்ளன; புதிய வேலை உள் கட்டுப்பாடுகளுடன் இரட்டை-இலக்கு வடிவத்திற்கு யோசனையை விரிவுபடுத்துகிறது, மேலும் வினைப்பொருட்களின் லியோபிலைசேஷன் மற்றும் ஒரு ஸ்ட்ரிப் ரீடரை நிரூபிக்கிறது.
• தற்போதைய கட்டுரையின் மதிப்பு என்ன? மிகவும் எளிமைப்படுத்தப்பட்ட மாதிரி தயாரிப்பிற்குப் பிறகு, கபத்திலிருந்து நேரடியாகக் கண்டறிதலை ஆசிரியர்கள் நிரூபித்தனர், உருவகப்படுத்தப்பட்ட கபத்தில் கண்டறிதல் வரம்பு ~70–80 CFU/ml, மற்றும் மருத்துவ மாதிரிகளின் ஒரு சிறிய குருட்டுத் தொகுப்பில் 100% உணர்திறன்/தனித்துவம் - மேலும் பல மைய சரிபார்ப்புகளுக்கு ஒரு நல்ல "தொழில்நுட்ப டெமோ".

இது எப்படி வேலை செய்கிறது?

• விஞ்ஞானிகள் RPA (37 °C இல் மரபணுப் பொருளின் விரைவான சமவெப்ப பெருக்கம்) ஐ "வெட்டும்" நொதிகளான Cas13a/Cas12a உடன் இணைத்தனர். வழிகாட்டி RNA களைத் தேர்ந்தெடுத்த பிறகு, அவர்கள் இரண்டு MBT இலக்குகளை ஒரே நேரத்தில் இலக்காகக் கொண்டு அமைப்பை உள்ளமைத்தனர், மேலும் மனித DNA க்கு இணையாகவும் (மாதிரியில் பொருள் இருக்கிறதா என்றும் எதிர்வினை "நிறுத்தப்படவில்லை" என்றும் சரிபார்த்தனர்).
• அனைத்து வேதியியலும் ஒரே சோதனைக் குழாயில் செல்கிறது; அடைகாத்த பிறகு, முடிவு ஒரு ஃப்ளோரிமீட்டர் அல்லது பக்கவாட்டு ஓட்டப் பட்டையில் படிக்கப்படுகிறது - அடிப்படையில் ஒரு எக்ஸ்பிரஸ் சோதனை போல.
• நியூக்ளிக் அமில பிரித்தெடுக்கும் கருவிகள் இல்லாமல், சளிச் செயலாக்கம் வெப்பமாக்கல் மற்றும் ஒரு குறுகிய மையவிலக்குக்கு எளிமைப்படுத்தப்பட்டுள்ளது. மிகவும் வரையறுக்கப்பட்ட சூழ்நிலைகளுக்கு, மையவிலக்குக்கு கைமுறை மாற்றுகளைப் பற்றி ஆசிரியர்கள் விவாதிக்கின்றனர்.

சோதனைகள் என்ன காட்டின

• கண்டறிதல் வரம்பு: "ஸ்பைக்" ஸ்பூட்டத்தில் 69.0 CFU/ml (ஸ்ட்ரெய்ன் H37Rv) மற்றும் 80.5 CFU/ml (BCG). மற்ற பாக்டீரியா/பூஞ்சைகளுடன் குறுக்கு-வினைத்திறன் எதுவும் கண்டறியப்படவில்லை.
• மருத்துவ அமைப்பு (குருட்டு மாதிரிகள்): உண்மையான நடைமுறையில் இருந்து 13 மாதிரிகளில் - விதைப்புடன் ஒப்பிடும்போது 100% உணர்திறன் (6/6) மற்றும் 100% தனித்தன்மை (7/7). ஒப்பிடுகையில், அதே கருவியில் GeneXpert Ultra முறையே 100%/86% காட்டியது.
• தொழில்நுட்ப நுணுக்கங்கள்: இரண்டு வாசிப்பு விருப்பங்களில், Cas13a சிறப்பாக செயல்பட்டது ("ஒரு-பாட்" வடிவமைப்பிற்கு, இது Cas12a ஐ விட அதிக உணர்திறன் கொண்டது). கூடுதலாக, இரண்டு Mtb இலக்குகளின் இணையான சோதனை தவறான முடிவுகளின் அபாயத்தைக் குறைக்கிறது.

இது ஏன் அவசியம்?

இன்றைய சோதனைகள் துல்லியம், வேகம் மற்றும் கிடைக்கும் தன்மை ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான சமரசமாகும்: கல்ச்சர் மிகவும் துல்லியமானது ஆனால் மெதுவாக உள்ளது; ஸ்வாப்கள் வேகமானவை ஆனால் துல்லியமற்றவை; ஜீன்எக்ஸ்பெர்ட் போன்ற PCR அமைப்புகள் துல்லியமானவை மற்றும் வேகமானவை, ஆனால் விலையுயர்ந்த கருவிகள் மற்றும் தோட்டாக்கள் தேவைப்படுகின்றன. புதிய CRISPR அணுகுமுறை இடைவெளியை மூடுவதை நோக்கமாகக் கொண்டுள்ளது: 37°C இல் செயல்படும் புல கண்டறிதல், காகித துண்டு அளவீடுகள் மற்றும் குளிர்பதனம் இல்லாமல் வினைப்பொருட்களை சேமிக்கும் திறன்.

வரம்புகள் மற்றும் அடுத்து என்ன

இது ஒரு சிறிய மருத்துவத் தொகுப்பில் ஆரம்பகால ஆர்ப்பாட்டம் - பெரிய, பல-மைய சோதனைகள் தேவை (குழந்தைகளில், பாசிபாசில்லரி வடிவங்கள் மற்றும் வெவ்வேறு MBT கோடுகளுடன் HIV இணை தொற்று உட்பட). "புல" பதிப்பிலேயே, டேப்லெட் மையவிலக்கு முழுமையாக கையேடு தீர்வுடன் மாற்றப்பட வேண்டும் என்று ஆசிரியர்கள் தனித்தனியாகக் குறிப்பிடுகின்றனர். ஆனால் கட்டமைப்பு - ஒரு சோதனைக் குழாயில் "இரண்டு இலக்குகள் + உள் கட்டுப்பாடு" - ஏற்கனவே அதன் செயல்பாட்டுத் திறனை நிரூபித்துள்ளது மற்றும் வெகுஜன பயன்பாட்டிற்கான சுத்திகரிப்புக்கான தெளிவான பாதையை வழங்குகிறது.

மூலம்: அலெக்ஸாண்ட்ரா ஜி. பெல் மற்றும் பலர். சளியிலிருந்து நேரடியாக காசநோயைக் கண்டறிவதற்கான ஒரு நெறிப்படுத்தப்பட்ட CRISPR அடிப்படையிலான சோதனை, சயின்ஸ் அட்வான்சஸ், ஆகஸ்ட் 6, 2025 அன்று ஆன்லைனில் (தொகுதி 11, இதழ் 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206